原文作者：Sarah DeWeerdt
從突觸入手繪製大腦的工作日漸增多。但隨着數據不斷累積，研究人員必須找到使它們變得有用的方法。
2019 年 4 月，西雅圖艾倫腦科學研究所。房間里有五台透射电子顯微鏡，三隻閃亮的派對氣球四處飄蕩，氣球是為了慶祝研究所最新取得的具有里程碑意義的研究成果——科研人員繪製了 1 立方毫米（約一粒沙子的大小）小鼠大腦組織內的 10 萬個神經元及其之間的約 100 億個連接，或者叫做“突觸”。
在神經元繪製遊戲 Eyewire 中，小鼠視網膜兩個神經元之間的突觸（藍色的為視網膜神經節細胞；黃色的為無長突細胞）。來源：Alex Norton/Eyewire
這五台透射电子顯微鏡連續運行了五個月，採集了 25,000 張小鼠視皮層切片的逾 1 億張圖片，每張切片的厚度只有 40 納米。隨後，研究人員使用研究所開發的軟件，用了大約三個月的時間將這些圖像進行了三維重建。3 個氣球上分別用藍色和銀色字母拼出了“2PB”（2 拍字節，相當於 200 萬千兆字節），這是整個數據集的大小。30 多年的“陸地衛星計劃”（Landsat missions）拍攝的地球照片也不過 1.3PB，這麼看來小鼠的大腦圖片簡直可以說是“一沙一世界”（a world in a grain of sand）了，研究所的神經生物學家 Clay Reid 引用 William Blake 的詩句說道。
除此之外，還有多個類似“小鼠大腦立方毫米計劃”的大腦納米尺度連接組繪製項目正在進行中。所謂連接組，就是神經元與神經元之間的突觸連接。神經科學家認為連接組圖譜將能夠幫助他們以前所未有的方式了解神經迴路如何編碼信息並指揮行動——簡而言之，就是大腦是如何運行的。
距離該領域的終極目標——在納米尺度上描繪完整的人類大腦連接組還有很長的路要走。人類大腦有 1015 個連接，包含約 1000 億個神經元，這個数字幾乎與銀河系中恆星的數目相當。如果使用當前的成像技術，需要數十個顯微鏡連續工作幾千年才能收集完所有的數據。
但是，顯微鏡技術的進步及圖像分析專用計算機和算法的發展已大大推動了連接組學領域的進展，即便是身處其中的研究人員也對如此之高的發展速度大為驚訝。“立方毫米計劃如果放在五年前，我們都會覺得太不切實際了。”Reid 說。而現在許多研究人員相信對整個小鼠大腦——體積約為 500 立方毫米——進行繪製完全有可能在未來十年內實現。如果這一計劃按部就班地實現了，那麼繪製體積更大的人類大腦不過是一個合理的長期目標。“今天，在突觸水平上繪製人類大腦可能看起來不可思議。但如果計算能力和科學技術持續穩步發展，規模再擴大 1000 倍也不是完全不可能。”
從小着手
目前共有兩個物種的連接組圖譜已完成：第一個是一種線蟲——秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans），完成於 1986 年【1】；第二個是一種海洋生物的幼蟲——玻璃海鞘（Ciona intestinalis），完成於 2016 年【2】。這兩個神經圖譜均是非常出色的篩選工具。“秀麗隱桿線蟲連接組圖譜已經否定了許多之前提出的可能假設。”美國阿貢國家實驗室的神經科學家 Bobby Kasthuri 說。如果某些關於線蟲神經系統或行為的發現可以用連接組圖譜輕而易舉地解釋，那就沒有進一步研究的必要；研究人員可以儘早調整方向，探索潛在產出更高的領域。但如果連接組學無法為觀察結果提供現成的解釋，那意味着這是一個值得探索的主題。
但也有部分研究人員對目前納米尺度連接組學所獲的關注持懷疑態度。專註研究視覺系統的紐約大學神經科學家 Anthony Movshon 表示，這些連接組項目耗費了大量時間、精力和金錢，產出和投入可能不成正比。當涉及複雜大腦，譬如小鼠或人類的大腦時，“我不需要知道每個細胞、每個突觸的具體連接細節，”Movshon 說，“我需要知道的是將整個體系連接起來的原則。”他認為這些數據完全可以在相對較粗略的分辨率上收集。儘管如此，納米尺度連接組仍是許多科學家追求的目標。他們認為連接組圖譜可以幫助破解精神疾病的起源，從而制定更有效的治療方案，同時圖譜還可以應用於其他許多領域，如人工智能、節能計算等。
雨後春筍般湧現的連接組項目
20 世紀 80 年代，為繪製秀麗隱桿線蟲的納米尺度連接組，英國劍橋大學的生物學家 Sydney Brenner 帶領研究團隊將幾毫米長的線蟲切成非常薄的切片，隨後使用安裝在电子顯微鏡上的膠片相機對每張切片進行了仔細的拍攝。最後研究人員根據所得的圖像，不遺餘力地手動追溯神經元通路以及其中涉及的連接。
但秀麗隱桿線蟲只有 302 個神經元和大約7,600 個突觸。繪製其連接組所有的手動方法顯然無法用於更複雜的神經系統。因此科研人員並未認真考慮開展規模更大的項目， 直到 2004 年，兩位來自德國海德堡馬克斯·普朗克醫學研究所的科學家——物理學家 Winfried Denk 和神經解剖學家 Heinz Horstmann 建議使用自動式顯微鏡對大腦組織進行切片和成像，並通過特定軟件對圖像進行堆疊和重建【3】。
將要發表的規模最大的完整納米尺度連接組圖譜之一描繪的是大小約 100 立方微米的小鼠視網膜，包含約1,000 個神經元和 250,000 個突觸。德國馬克斯·普朗克神經生物學研究所現任主任 Denk 和他的合作者——馬克斯·普朗克腦研究所副主任 Moritz Helmstaedter 在 2013 年發表了其研究結果【4】。但是“小鼠大腦立方毫米計劃”面對的是 10 萬個神經元，其他類似的項目也在進行中。
“1 立方毫米的體積已足夠了解大部分局部連接，尤其對於位於中間部分的神經元來說。” 艾倫研究所的神經科學家 Nuno da Costa 說。因此，依據小鼠大腦計劃獲得的圖譜，科學家將能夠探索完整的局部神經迴路，而非單個神經元和周圍稀疏的連接網絡。艾倫研究所進行的研究是和美國貝勒醫學院、普林斯頓大學和哈佛大學合作開展的，由美國政府資助，項目名為“皮層網絡機器智能”。
根據“小鼠大腦立方毫米計劃”目前的進展，有的研究人員預測完整的小鼠大腦的納米尺度連接組圖譜將在未來十年內產生，最終數據大小可能約 1EB（100 億 GB）。“這個目標可能需要許多實驗室合作才能實現。”哈佛大學神經科學家 Jeff Lichtman 說。“但至少這個目標是可能實現的，”他說，“這一點非常讓人興奮。”
其他人則繼續保持謹慎的態度。美國霍華德·休斯醫學研究所的計算機專家 Stephen Plaza 說，規模如此龐大的項目“將面臨諸多後勤方面的挑戰”。他認為在涉足鼠腦這類複雜神經系統之前，連接組學領域應該先從一些中等規模的項目入手。“在連接組學領域，我們目前仍處於學步狀態。”他說。
Plaza 目前就負責着一個這樣的項目——FlyEM，該項目旨在繪製黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的中樞神經系統連接組圖譜。其團隊預計將在 2020 年初發布約三分之一黑腹果蠅大腦的數據。Plaza 希望在接下來的幾年中能夠進一步繪製整个中樞神經系統的連接組——包括果蠅大腦中的約 100,000 個神經元和 1 億個連接，以及腹側神經索（大致相當於脊椎動物的脊髓） 中類似數量的神經元和突觸。
與此同時，Lichtman 正在研究斑馬魚（Danio rerio）連接組，並嘗試着對一小塊人類大腦組織進行分析——這塊組織是從因為癲癇而接受腦外科手術的患者那裡獲得的內側顳內取得的樣本。該組織樣本的體積大約也為 1 立方毫米，但考慮到人類大腦皮層的厚度，樣本形狀更類似平板，而不是立方體。
Denk 和他的同事正在繪製斑胸草雀（Taeniopygia guttata）的連接組，從這種小鳥學習歌唱的過程中，可以側面了解人類的語言學習過程。Kasthuri 也有許多項目正在進行中。“現在我們已經有大量關於小鼠大腦神經迴路的數據，我認為最好的研究方法是進行橫向（跨物種）或縱向（發育過程）的比較，”他說， “最重要的信息往往來自相互比較。”
為此，Kasthuri 計劃繪製非人靈長類動物以及章魚（Octopus bimaculoides）大腦中的視覺中樞部分。“章魚和人類差異非常大，但又極具智慧。”他說， “因此我非常期待將章魚和小鼠的大腦連接組放在一起進行比較。”
同時，Kasthuri 還致力於繪製幼年小鼠和章魚的完整連接組圖譜——將這些尚未成熟的連接組與成年動物的連接組進行比較，有助於深入了解大腦如何從經驗中學習。考慮到章魚大腦相對較小，Kasthuri 希望能在一年內完成幼年章魚連接組圖譜的繪製。
輪到 AI 大顯身手了
目前艾倫研究所的研究人員已完成了對立方毫米小鼠大腦的圖像採集，並將這些數據發送給了普林斯頓大學的神經科學家和計算機科學家 Sebastian Seung。Seung 的實驗室將根據圖像進行三維重建，對突觸進行標註，並對標本內總長約 4 千米的神經纖維進行分段描繪。
分段一直是連接組學研究中的限速步驟。如果採用傳統手工方法，通過大量顯微鏡照片追溯單個神經元的纖維路徑可能就需要花費數周時間。但現在，我們有了人工智能。Seung 的團隊開發的機器學習算法可以逐像素地對圖像進行評估，確定神經元的具體位置。
相比人眼，計算機的分段速度更快，能夠將追蹤神經元所需的時間縮短到幾小時甚至幾分鐘。但這種分段並沒有那麼準確：計算機算法可能會遺漏一些神經元或將兩個神經元誤認為一個。因此計算機得出的重建圖譜仍需要人工複核。Seung 的團隊提出通過眾包的方式完成複核，他們特別推出了一款名為 Eyewire 的在線遊戲，遊戲玩家需要找到連接組圖像草稿中的錯誤並進行糾正。Eyewire 的執行董事 Amy Robinson Sterling 表示，自 2012 年推出以來，Eyewire 已擁有 290,000 名註冊用戶，這些玩家的貢獻等同於 32 名全職工作人員連續工作 7 年。
“發育大腦連接組項目”（Developing Human Connectome Project）主要針對新生兒大腦中的神經纖維進行成像。來源：Max Pietsch/DHCP
到目前為止，玩家們一直在在追蹤小鼠視網膜中的細胞，他們共幫助發現了六種神經元，並選擇以古希臘神的名字對其命名。Sterling 和她的團隊正在準備一個名為“Neo”的新版遊戲，遊戲將使用小鼠視覺皮層數據集。
Neo 的遊戲界面將基於谷歌開發的 Neuroglancer 程序，該程序能夠將平面的黑白电子顯微照片轉化為彩色的神經元 3D 網絡。許多納米尺度連接組繪製項目都使用該程序來對數據進行可視化處理。
谷歌還開發了一款神經元分段算法——泛洪算法網絡，由加利福尼亞州 Google AI 的 Viren Jain 帶領團隊設計出來。該算法從圖像中的某個點開始逐步構建結構，而非試圖一下子明確所有神經元的邊界。“這就有點像人們在填色書里塗色。”Jain 說。他的團隊正在將該技術應用於 FlyEM 數據，並已基於珍利亞研究園區另一個團隊提供的顯微照片，構建了完整果蠅大腦的粗略連接組圖譜。另外，他們還在用算法處理 Denk 和 Lichtman 實驗室的數據。
“他們構建的連接組看起來真的很漂亮，”Lichtman 提到算法處理結果時說道，並指出該算法追蹤神經元的速度遠比他團隊收集顯微照片的速度快。“我們無法趕上他們的速度。”他補充道， “那是一個很棒的地方。”
Jain 非常謹慎地提醒說，隨着項目規模逐漸擴大，分段算法必須更加精確，保證所需的人工複核工作量在可行的範圍內。
提高圖像採集精度及速度
與此同時，科學家也在不斷改進顯微鏡技術，希望能以更快的速度生成更清晰、更細緻的圖像，為繪製哺乳動物大腦的納米尺度連接組做準備。
連接組學研究中使用的傳統顯微鏡叫做連續切片电子顯微鏡。研究人員將神經組織嵌入塑料中，並切成厚度和人類頭髮差不多的切片。接着，他們將切片放置在專用膠帶條上，就和卷在捲筒上的膠片類似，然後將膠帶條放入顯微鏡中進行拍攝。
這種方法的優點是樣品能夠長期保存，如有需要，可以反覆成像。但無論做得多麼精確，切割樣品都不可避免地會造成偏差，最終影響圖像重建。
現在比較新的一種方法叫做聚焦離子束掃描电子顯微鏡（FIB-SEM）：使用帶電離子束刮掉一層薄薄的組織樣本，顯微鏡拍攝新暴露的表面，然後不斷重複這個過程。FlyEM 項目是該方法第一次在如此大的規模上得到應用。
雖然 FIB-SEM 速度並不快，但它有一個非常顯著的優點，那就是所產生的圖像在三個維度上的分辨率是相同的，而傳統方法生成的圖片垂直方向上會相對粗糙。但是，組織樣品在該過程中會汽化，因此無法反覆成像。另外，FIB-SEM 的視野非常小，因此無法用於更大的樣本。（即使是罌粟種子大小的果蠅大腦也必須進一步切成小塊。）珍利亞研究園區的神經科學家 Kenneth Hayworth 開發的氣體團簇離子束掃描电子顯微鏡（GCIB-SEM）工作方式相似，但視野較大，因此更適合於體積更大的腦組織成像。
GCIB-SEM 可能與多光束电子顯微鏡的兼容性更好，研究人員希望多束电子束同時掃描樣品能夠能加快圖像採集速度。Lichtman 實驗室使用的是由 Carl Zeiss 製造的有 61 道光束的顯微鏡，Denk 實驗室則有 91 束，包含數百個光束、最終有望每秒採集一千萬像素圖像數據的电子顯微鏡也正在研發中。
挖掘數據背後的意義
但速度也會帶來問題。如今納米尺度連接組項目正在迅速產生大量數據，隨之而來的挑戰就是如何解讀這些數據。“我們手邊有這麼多已經經過處理的數據，” Reid 說， “大量的科學家可以經常性地在這個數據集上有新的發現。而我們現在遠沒有那麼多科研人員。”
另一個問題是如何將納米尺度連接組數據與其他更大規模的神經科學項目（如人類連接組項目）聯繫起來。人類連接組項目對大約 1200 個研究對象的大腦進行了磁共振掃描，根據所得圖像從毫米尺度了解連接大腦不同區域的神經纖維，最終繪製了名為宏觀連接組的圖譜。
“神經科學中最大的問題就是尺度。”倫敦國王學院的新生兒學家 David Edwards 說。他是發育大腦連接組項目的參与者之一，該項目主要對數百個宮內胎兒、足月兒及早產兒的大腦進行掃描。“在宏觀層面、微觀層面、人口學層面都有非常精彩的研究正在進行中，”David Edwards 說，“但我們沒辦法將不同層面的研究聯繫在一起。”
在某些方面，甚至比納米尺度連接組更詳細的新數據也在不斷出現。譬如，通過連接組數據，我們只能了解突觸的位置，而無法知曉其分子組成。“我認為這是我們需要填補的一項空白，”英國愛丁堡大學的分子神經科學家 Seth Grant 說， “否則就無法找到將其與基因組學之間的聯繫。”Grant 認為基因組學信息對於研究演化和遺傳學對大腦功能產生了怎樣的影響至關重要。
歡迎來到突觸的世界。在 2018 年發表的一篇論文中，Grant 和他的團隊對小鼠整個大腦中約 100 億個突觸進行了分類【5】。他們根據蛋白含量、大小和形狀，共將突觸分為 37 個亞型，並確定了不同大腦區域中突觸亞型的分佈。Grant 團隊也開始着手將突觸亞型與其構成的連接聯繫起來。“將突觸組和連接組聯繫起來，”Grant 說，“將是未來的一大研究前沿。”
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